在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，食品安全始終是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。其中，由致病性弧菌（Vibrio）引起的食源性疾病不僅對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成威脅，還對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法往往耗時(shí)且靈敏度不足，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。然而，最近一項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)出了一種結(jié)合免疫磁珠分離（IMBS）和對(duì)流PCR（CPCR）的新型檢測(cè)技術(shù)，為解決這一問(wèn)題帶來(lái)了曙光。
技術(shù)背景與需求
弧菌是一類廣泛存在于水環(huán)境中的革蘭氏陰性細(xì)菌，其中一些種類如副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等具有致病性，能夠引發(fā)人類的腸胃炎、傷口感染等多種疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，弧菌的污染尤為常見(jiàn)，尤其是在養(yǎng)殖水體、飼料以及水產(chǎn)品中。由于弧菌的多樣性和快速傳播能力，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和PCR檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多局限性。微生物培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要數(shù)天才能得到結(jié)果；而傳統(tǒng)PCR需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)人員操作，難以在現(xiàn)場(chǎng)快速應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏且適合現(xiàn)場(chǎng)使用的檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫。
免疫磁珠分離-對(duì)流PCR技術(shù)的開(kāi)發(fā)
最近，寧波大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種名為免疫磁珠分離-對(duì)流PCR（IMBS-CPCR）的新型檢測(cè)技術(shù)，專門用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的四種致病性弧菌：溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）。該技術(shù)的核心在于結(jié)合了IMBS和CPCR兩種先進(jìn)技術(shù)。
CPCR是一種基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)的改進(jìn)方法，通過(guò)利用流體密度差實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物在冷熱區(qū)域之間的持續(xù)循環(huán)，從而無(wú)需主動(dòng)泵送即可完成核酸擴(kuò)增。與傳統(tǒng)PCR相比，CPCR設(shè)備更加便攜，試劑消耗更少，且操作簡(jiǎn)便，特別適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在本研究中，研究人員針對(duì)四種弧菌分別優(yōu)化了CPCR的退火溫度、延伸溫度、反應(yīng)時(shí)間和引物濃度等條件，確保了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。
圖1 免疫磁珠條件優(yōu)化結(jié)果。(A)、(B)、(C) 分別代表抗原濃度、磁珠濃度和磁珠富集時(shí)間的優(yōu)化百分比。不同顏色代表四種不同的弧菌。點(diǎn)代表平均值，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。
免疫磁珠分離技術(shù)則是利用與磁性微球結(jié)合的特異性抗體，能夠高效地從復(fù)雜樣本中富集目標(biāo)細(xì)菌。在本研究中，研究人員通過(guò)優(yōu)化抗體用量、磁珠濃度和捕獲時(shí)間等條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)弧菌的高效率捕獲，捕獲率高達(dá)82.6%至83.3%，而非目標(biāo)細(xì)菌的捕獲率則低于11%。這一技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其高特異性和高靈敏度，能夠在低濃度下檢測(cè)到目標(biāo)細(xì)菌，最低檢測(cè)限可達(dá)10 CFU/mL。
圖2 免疫磁珠對(duì)靶標(biāo)細(xì)菌和非靶標(biāo)細(xì)菌的捕獲率。細(xì)菌被分為兩組：靶標(biāo)細(xì)菌（四種弧菌）和非靶標(biāo)細(xì)菌。星號(hào)表示靶標(biāo)細(xì)菌和非靶標(biāo)細(xì)菌的捕獲率之間存在顯著差異（P<0.01）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用前景
IMBS-CPCR技術(shù)的結(jié)合，不僅提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，還大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。與傳統(tǒng)的直接CPCR或PCR方法相比，該技術(shù)在模擬魚樣中的檢測(cè)靈敏度提高了10至100倍。此外，該技術(shù)還具有便攜性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，特別適合在水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)、食品加工企業(yè)和海關(guān)等場(chǎng)所快速檢測(cè)弧菌污染。
在實(shí)際應(yīng)用中，研究人員通過(guò)模擬魚樣實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了IMBS-CPCR技術(shù)的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該技術(shù)能夠在低至101 CFU/mL的濃度下檢測(cè)到目標(biāo)弧菌，且與傳統(tǒng)PCR的結(jié)果一致，證明了其準(zhǔn)確性和可靠性。此外，該技術(shù)還能夠有效區(qū)分目標(biāo)弧菌和其他非目標(biāo)細(xì)菌，避免了誤報(bào)和漏報(bào)的可能性。
圖3 使用免疫磁珠分離 - 對(duì)流聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（IMBS-CPCR）和免疫磁珠分離 - 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（IMBS-PCR）檢測(cè)四種弧菌的結(jié)果對(duì)比。圖例顯示了四種弧菌的濃度，單位為 CFU/mL（菌落形成單位 / 毫升）。顏色的深淺代表在不同濃度下目標(biāo)弧菌的富集能力。顏色越深，表明可檢測(cè)到的弧菌濃度越高，對(duì)應(yīng)較低的靈敏度；反之，顏色越淺，表明可檢測(cè)到的弧菌濃度越低，對(duì)應(yīng)較高的靈敏度。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了三次重復(fù)。
結(jié)論與展望
IMBS-CPCR技術(shù)的開(kāi)發(fā)為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌檢測(cè)提供了一種全新的解決方案。該技術(shù)結(jié)合了免疫磁珠分離的高特異性和對(duì)流PCR的快速檢測(cè)能力，具有顯著的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。未來(lái)，隨著技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和商業(yè)化推廣，IMBS-CPCR有望在更廣泛的食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用，為保障公眾健康和促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮重要作用。
參考文獻(xiàn)：Zhang W, Yang Y, Kong F, et al. Development and optimization of immunomagnetic bead separation-convective PCR (IMBS-CPCR) for on-site detection of four common Vibrio species in aquaculture[J]. LWT, 2024, 211: 116928.
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
