細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(各種酶類試驗)
發(fā)布時間：2025-02-20 瀏覽次數(shù)：911
不同細(xì)菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因而對底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性，為此，可利用生物化學(xué)的方法測定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。本次內(nèi)容主要介紹的為細(xì)菌生物化學(xué)試驗中各種酶類試驗與抑菌試驗。
各種酶類試驗
1、氧化酶試驗
氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化的細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。
常用方法有三種：
① 菌落法：直接滴加試劑于被檢菌菌落上。
② 濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，沾取菌少許，然后加試劑。
③ 試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。
細(xì)菌在與試劑接觸10s內(nèi)呈深紫色，為陽性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。
主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，后者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。
2、過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）
具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。取菌置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后滴加3%過氧化氫數(shù)滴，或直接滴加3%過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。
有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。
3、硝酸鹽還原試驗
被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，于35°C培養(yǎng)1~4d，將甲液（對氨基苯磺酸0.8g＋5mol/L醋酸100ml）、乙液（α-萘胺0.5g＋5mol/L醋酸100ml）等量混合后（約0.1ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色為陽性。若加入試劑后無顏色反應(yīng)，可能是：
① 硝酸鹽沒有被還原，試驗陰性；
② 硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，這時應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗確實為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表示試驗為假陰性。
若要檢查是否有氮氣產(chǎn)生，可在培養(yǎng)基管內(nèi)加一小導(dǎo)管，如有氣泡產(chǎn)生，表示有氮氣生成。
本試驗在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。
4、脂酶試驗
將被檢菌接種于上述培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色為陽性，陰性為粉紅色或無色。
主要用于厭氧菌的鑒別。類桿菌屬中的中間類桿菌產(chǎn)生脂酶，其他類桿菌則陰性；芽胞梭菌屬中產(chǎn)芽胞梭菌、肉毒梭菌和諾維梭菌也有此酶，而其他梭菌陰性。
5、卵磷脂酶試驗
將被檢菌劃線接種或點種于卵黃瓊脂平板上，于35°C培養(yǎng)3~6h。若3h后在菌落周圍形成乳白色混獨環(huán)，即為陽性，6h后混獨環(huán)可擴(kuò)展至5~6mm。主要用于厭氧菌的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維梭菌產(chǎn)生此酶，其他梭菌為陰性。
6、DNA酶試驗
將被檢菌點種于上述平板上，于35°C培養(yǎng)18~24h，然后用1mol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果。
在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性，無透明環(huán)為陰性。在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶，故本試驗可用于細(xì)菌的鑒別。
7、凝固酶試驗
致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶。一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細(xì)胞壁上，使血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著于細(xì)菌表面，發(fā)生凝集，可用玻片法測出。另一種是分泌至菌體外的游離凝固酶，作用類似凝血酶原物質(zhì)，可被血漿中的協(xié)同因子激活變次凝血酶樣物質(zhì)，而使纖維蛋白原變成纖維蛋白，從而使血漿凝固，可用試管法測出。
（1）玻片法：兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的玻片上，挑取被檢菌分別與血漿和鹽水混合。
（2）試管法：取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿，挑取被檢菌和陽性對照菌分別加入血漿中并混勻，于37°C水浴3～4h。
玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)象判為陽性；試管法以血漿凝固判為陽性。作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。
8. CAMP試驗
先以產(chǎn)β-溶血素的金黃色葡萄球菌劃一橫線接種于血瓊脂平板上，再將被檢菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩線不能相交，相距0.5～1cm，于37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。
每次試驗都應(yīng)設(shè)陰性和陽性對照。在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)為陽性。在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。
9、膽汁溶菌試驗
膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，可能是由于膽汁降低細(xì)胞膜表面的張力，使細(xì)胞膜破損或使菌體裂解；或者是由于膽汁加速了肺炎鏈球菌本身自溶過程，促使細(xì)菌發(fā)生自溶。
（1）平板法：取10%去氧膽酸鈉溶液一接種環(huán)，滴加于被測菌的菌落上，置35°C 30min后觀察結(jié)果。
（2）試管法：被檢菌培養(yǎng)物2支，各0.9ml，分別加入10%去氧膽酸鈉溶液和生理鹽水（對照管）0.1ml，搖勻后置35°C水浴10~30min，觀察結(jié)果。
平板法以“菌落消失”判為陽性；試管法以“加膽鹽的培養(yǎng)物變透明，而對照管仍混濁”判為陽性。主要用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性。
抑菌試驗
1、O/129抑菌試驗
（1）原理：O/129（二氨基蝶啶）對弧菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對氣單胞菌屬細(xì)菌無抑制作用。
（2）培養(yǎng)基：堿性瓊脂平板。
（3）方法：將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上，鑷取O/129紙片（含藥40）貼于平板上，35°C培養(yǎng)18~24h觀察結(jié)果。
（4）結(jié)果：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥。
（5）應(yīng)用：用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。
2、桿菌肽試驗
將待檢菌純培養(yǎng)物（肉湯）均勻涂布于血液瓊脂平板上，稍干后貼上0.04U/片的桿菌肽紙片，35°C培養(yǎng)18~24h觀察結(jié)果。抑菌環(huán)直徑＞10mm為敏感，抑菌環(huán)直徑＜10mm為耐藥。用于A群鏈球菌與非A群鏈球菌的鑒別。
3、奧普托欣（optochin）試驗
將待檢菌菌落或肉湯培養(yǎng)液均勻涂布于血液瓊脂平板上，稍干后貼上含5μg/片的optochin紙片，35°C培養(yǎng)18~24h觀察結(jié)果。抑菌環(huán)直徑＞14mm為敏感，若抑菌環(huán)直徑≤14mm，對此菌株應(yīng)再做膽汁溶菌試驗，以證實是否為肺炎鏈球菌。主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。
文章來源：環(huán)凱（官網(wǎng)：huankai.com）轉(zhuǎn)載于“ 我是YY啊 ”公眾號；原作者~ 妍妍丫丫。
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