稀釋涂布平板法的幾個誤區(qū)
發(fā)布時間：2024-07-24 瀏覽次數(shù)：2124
稀釋涂布平板法是一種常見的微生物計(jì)數(shù)方法，該方法通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)推測樣品中活菌個數(shù)，其原理是將待測樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使樣品中的微生物細(xì)胞分散開。再取一定量的稀釋液均勻涂布到固體培養(yǎng)基表面。讓分散開的單個細(xì)胞繁殖得到一個菌落。這樣就可以通過肉眼可見的菌落數(shù)推理肉眼不可見的微生物細(xì)胞數(shù)。
稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的計(jì)算公式為每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V)×M，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數(shù)。學(xué)生對該公式的理解存在多種認(rèn)知誤區(qū)，導(dǎo)致此類問題得分率低，現(xiàn)結(jié)合典型試題進(jìn)行分析。
誤區(qū)一 對平均菌落數(shù)的理解
公式中的C不一定是所有實(shí)驗(yàn)所得菌落數(shù)的平均值。為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)說服力和減小實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)。此實(shí)驗(yàn)的對照實(shí)驗(yàn)是將未涂布菌液的培養(yǎng)基放置在相同條件下培養(yǎng)，其目的是排除培養(yǎng)基污染對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。若空白對照組平板出現(xiàn)菌落,則說明空白對照組的平板被污染，進(jìn)而推測實(shí)驗(yàn)組平板也可能被污染，這種情況不能直接將實(shí)驗(yàn)組平板的菌落數(shù)取平均值，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只有空白培養(yǎng)基沒有出現(xiàn)菌落，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才可信。此實(shí)驗(yàn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布3個平板（一般設(shè)置3—5個平板）。選擇菌落數(shù)在30—300的平板計(jì)算平均菌落數(shù)。若重復(fù)實(shí)驗(yàn)中某個平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠(yuǎn)，如四個平板的菌落數(shù)分別為42、200、256、234，菌落數(shù)42與其他數(shù)值差異過大，說明該平板操作過程有誤，則該菌落數(shù)應(yīng)舍棄。若舍棄后不足三個平板，不能用菌落數(shù)相近的兩個平板取平均值，應(yīng)找到原因并重做實(shí)驗(yàn)。若計(jì)算每克樣品中的某種菌株數(shù)，則C應(yīng)代表某一稀釋度下平板上生長的符合該菌菌落特征的菌落數(shù)的平均值，培養(yǎng)基上其他菌種形成的菌落數(shù)不能一并計(jì)算在內(nèi)。如檢測1L待測水樣中的大腸桿菌數(shù)目只統(tǒng)計(jì)大腸桿菌菌落數(shù)的平均值。
誤區(qū)二 對稀釋倍數(shù)的判定
平板中菌落數(shù)過少會導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差過大，菌落數(shù)過多又會造成計(jì)數(shù)困難，為確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測定，應(yīng)合理設(shè)定稀釋倍數(shù)。待測樣品中微生物數(shù)量越多，所需稀釋倍數(shù)越大，而微生物數(shù)量越少，所需稀釋倍數(shù)越小。如測定土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用104、105和106倍稀釋：測定放線菌數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋；測定真菌數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋：測定自來水中大腸桿菌數(shù)量，一般不稀釋，直接進(jìn)行涂布培養(yǎng)。人教版高中生物教材給出的樣品稀釋的流程示范是將10g土樣加入到90mL無菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1mL加入到9mL無菌水中得到稀釋100倍的樣液，依次類推。若取6g土樣配制成稀釋10倍的土壤溶液，則土壤占混合液的10%，土壤溶液總量為60mL，應(yīng)添加54mL的無菌水。若取1g土樣配制成稀釋100倍的土壤溶液，則土壤占混合液的1%，土壤溶液總量100mL，應(yīng)添加99mL的無菌水。
誤區(qū)三 對體積與質(zhì)量的單位換算
微生物計(jì)算公式中的V代表涂布平板時所用稀釋液的體積，通常為0.1mL。但若待測樣品中微生物數(shù)目較少，接種0.1mL經(jīng)培養(yǎng)后平板上菌落數(shù)達(dá)不到30?？稍龃蠼臃N量（如接種1mL）。試題中經(jīng)常改變涂布平板時所用的稀釋液和所求樣品的體積和質(zhì)量，要注意做好單位換算，如1cm3=103μL=1 mL=10L。體積和質(zhì)量的換算公式是體積=質(zhì)量：密度（V=m/p），水的密度是1g/cm3，則質(zhì)量頭1 g的水的體積是1 cm3即1 mL。
誤區(qū)四 對統(tǒng)計(jì)誤差的分析
從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的原理分析，運(yùn)用該方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。因?yàn)闃悠芬话悴灰淄耆稚⒊蓡蝹€細(xì)胞，當(dāng)兩個或多個活細(xì)胞連在一起時。平板上觀察到的只是一個菌落，從稀釋涂布平板計(jì)數(shù)的過程分析 稀釋倍數(shù)是否合適、涂布是否均勻、培養(yǎng)環(huán)境是否能保證微生物正常生長、計(jì)數(shù)是否存在漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)等情況都會影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。除此之外，還要考慮培養(yǎng)時間對菌落數(shù)目的影響。菌落數(shù)目需要每隔一段時間統(tǒng)計(jì)一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時間不足遺漏菌落的數(shù)目。
來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“食品微生物檢測”公眾號，原作者~未知，內(nèi)容版權(quán)歸原作者所有；
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