DNA提取基本知識（裂解與純化詳細(xì)介紹！）
發(fā)布時(shí)間：2023-08-23 瀏覽次數(shù)：6986
DNA提取分為裂解和純化兩大步驟，裂解的目的是破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞中的DNA游離在裂解體系中，純化的目的是使DNA與裂解體系中的其它組分（蛋白質(zhì)、鹽、多酚等）分離。
裂 解
常規(guī)的裂解液都含有去污劑(如SDS、CTAB、Triton X-100、NP-40、Tween 20等)和鹽(如Tris、EDTA、NaCl等)。去污劑能使蛋白質(zhì)變性、破壞膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除與核酸相互結(jié)合的蛋白質(zhì)。鹽能夠提供合適的裂解環(huán)境、抑制核酸酶的降解作用，維持核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)DNA與蛋白質(zhì)的分離，同時(shí)也便于后續(xù)的純化操作。
純 化
沉淀法
利用酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)，再用乙醇或異丙醇沉淀DNA。
* 酚氯仿抽提是去除蛋白質(zhì)的有效手段，但如果蛋白質(zhì)含量超過了其飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)就不會被一次性去除，需要進(jìn)行多次反復(fù)抽提，而每次的抽提均會導(dǎo)致核酸的損失。
圖1 沉淀法DNA提取過程示意圖
離心柱法
通過離心柱上的吸附膜，特異性吸附DNA。
* 離心柱法受人為操作因素影響小，提取DNA的純度穩(wěn)定性很高，其缺點(diǎn)是當(dāng)樣品過量時(shí)，需反復(fù)進(jìn)行離心，對樣品的提取效率較低。
圖2 離心柱法DNA提取過程示意圖
磁珠法
將純化介質(zhì)包被在納米級的磁珠表面，通過介質(zhì)對DNA的吸附作用，在外加磁場的作用下使DNA附著于磁珠并定向移動，從而達(dá)到核酸與其它物質(zhì)分離的目的。
圖3 磁珠法DNA提取過程示意圖
三種純化方法的比較：
| 純化方法 | 沉淀法 | 離心柱法 | 磁珠法 |
|---|---|---|---|
| 優(yōu)點(diǎn) | 樣本處理體積靈活、產(chǎn)量高 | 操作簡便、快速，更安全，產(chǎn)物純度高可用于下游實(shí)驗(yàn) | 通量高，可實(shí)現(xiàn)自動化操作，產(chǎn)物純度高 |
| 缺點(diǎn) | 安全性低，無法進(jìn)行高通量提取且純度較低 | 存在堵住風(fēng)險(xiǎn)，對樣本起始量有限制 | 需要搭配使用磁力架，成本相對較高 |
| 選擇依據(jù) | 時(shí)間充裕，樣本量相對充足 | 操作簡便、省時(shí)，提取出的DNA可應(yīng)用于絕大多數(shù)下游實(shí)驗(yàn) | 下游需要高純度的DNA進(jìn)行自動化提取 |
DNA提取基本原則
保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性
DNA結(jié)構(gòu)的完整性會根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)的目的而有所區(qū)別。如PCR、Southern雜交這一類實(shí)驗(yàn)基本保證所需片段的完整即可，二代測序?qū)嶒?yàn)為了獲得全面的序列信息對DNA的完整性要求較高，三代測序則要求DNA片段的完整性比二代測序更高。
保證DNA的純度
去除對下游實(shí)驗(yàn)中酶分子有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度金屬離子；
將蛋白質(zhì)、多糖、多酚等生物大分子的污染降到最低；
去除RNA（如RNA對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響）。
常見問題解決方案
Q1. DNA降解
(1) 選擇新鮮樣本，減少內(nèi)源酶的作用；
(2) 樣本初始量不要超過所用方法的初始量標(biāo)準(zhǔn)；
(3) 樣本避免反復(fù)凍融；
(4) 選擇合適的處理方式并進(jìn)行充分的樣本前處理；
(5) 前處理結(jié)束后在樣本解凍前添加裂解液；
(6) 正確添加所需試劑種類及使用量，樣本量增加時(shí)裂解液也需成倍增加；
(7) DNA產(chǎn)物進(jìn)行分裝保存，避免反復(fù)凍融且保存時(shí)間不宜太久。
Q2. DNA產(chǎn)量低
(1) 對提取樣本中DNA含量水平有一定了解；
(2) 選擇合適的前處理及裂解方式（如延長裂解和DNA沉淀的時(shí)間等），盡可能的將樣本中的DNA完全釋放出來；
(3) 使用柱式試劑盒對DNA產(chǎn)物洗脫的時(shí)候，要盡量覆蓋整個(gè)吸附膜；進(jìn)行二次洗脫也可增加產(chǎn)量。
Q3. DNA純度低
? 初始樣本過量易導(dǎo)致裂解也不完全；
? 樣本應(yīng)進(jìn)行充分裂解，特別是對于一些比較復(fù)雜、含有較多雜質(zhì)（多糖、多酚等）的樣本需進(jìn)行特殊處理；
? RNA殘留：使用RNase對RNA進(jìn)行處理，處理時(shí)間不宜太短或太長（10 min左右）；
? 蛋白殘留：使用蛋白變性劑或蛋白酶K；沉淀法分層吸取上清時(shí)注意不要吸到下層沉淀蛋白。
