不同的細(xì)胞，喜歡的環(huán)境是不一樣的

有一些細(xì)胞是數(shù)量多一點(diǎn)比較好生長，生長狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長速度慢的細(xì)胞，譬如內(nèi)皮細(xì)胞。而有一些細(xì)胞是數(shù)量少一點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)會(huì)生長的比較好，譬如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞。

巨噬細(xì)胞，生長速度非?？?，貼壁速度很快，所以傳代時(shí)就應(yīng)該留很少量的細(xì)胞，這樣細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比較好。并且它比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的。如果長得連成一片，細(xì)胞形態(tài)就會(huì)差，老化的會(huì)比較多，對(duì)后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不好。

所以在養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候應(yīng)該摸索該細(xì)胞喜歡的生長空間密度。

養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)怎么都不好？

對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果細(xì)胞形態(tài)不好或者細(xì)胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等，可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作：

首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入 3 ml 新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走。然后再加入 3 ml 的培養(yǎng)基，進(jìn)行預(yù)吹打，控制吹打力度，輕輕地沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時(shí)侯再開始正式的消化、吹打。巨噬細(xì)胞我只吹打，不消化。

其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況。 10 、20 、30 分鐘觀察一次。選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺(tái)，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入 3 ml 新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細(xì)胞生長情況以及形態(tài)。我稱之為“二傳”。

如果一次效果還不理想，可重復(fù)多次。直到找到細(xì)胞完美形態(tài)。其中要注意，結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長情況。喜歡多一點(diǎn)數(shù)量長得好的細(xì)胞你就等貼壁細(xì)胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳。反之亦然。

培養(yǎng)瓶內(nèi)加入多少培養(yǎng)基？

這個(gè)是要靠自己針對(duì)自己養(yǎng)的細(xì)胞去摸索。并不是小的玻璃方瓶 要 12 ml，大方瓶要 14 ml 。有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會(huì)長得比較好。對(duì)于生長速度快的細(xì)胞，易生長的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好。但是要注意換。

如何選擇培養(yǎng)瓶？

生長速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對(duì)“更安逸”的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。所以對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會(huì)好，對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞，玻璃瓶則會(huì)更好。

同樣，對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長速度慢的時(shí)候，塑料瓶會(huì)好一點(diǎn)，比如剛剛復(fù)蘇的時(shí)候，或者原代培養(yǎng)的時(shí)候。而在其生長旺盛的時(shí)候，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn)。

傳代時(shí)怎么消化？

可以這樣說，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好最至關(guān)重要的考驗(yàn)。

在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個(gè)問題。細(xì)胞的生長狀態(tài)是不一樣的，每一個(gè)細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的。我后來對(duì)消化的方法進(jìn)行了改良，我稱之為“四步消化法”。以難消化細(xì)胞為例，具體操作如下：

首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗 1-2 遍，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。

然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰長的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度。

吸干凈瓶內(nèi)剩余液體，加入 0.3 ml 左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 ml 左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 ml 左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對(duì)比。

然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進(jìn)瓶里，繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞獨(dú)立開來的時(shí)候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)，根據(jù)你實(shí)際情況自己把握。

其實(shí)還可以有第五步，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細(xì)胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能最大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到最低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠最優(yōu)。

當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定。就沒必要第三步第四步了。這個(gè)需要你在實(shí)驗(yàn)中自己用心去體會(huì)。建議你接受一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來做比較，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求。便于你后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以最大程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài)，不成片不連體。

因?yàn)榧?xì)胞生長的時(shí)候肯定是要相互聯(lián)系，大部分的細(xì)胞都是要成片生長的，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡。所以，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài)，這個(gè)非常考究你的功夫。

細(xì)胞一旦脫落入懸液里，你很難再將他吹打成單個(gè)。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。既要消化到容易吹打下來，又不能太過，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。

另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是，一定不能等到細(xì)胞長滿的時(shí)候才去消化傳代。要在細(xì)胞長到 70% 左右的時(shí)候就要傳代了，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長中已經(jīng)有疊層生長的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代。不能再拖了。

換液傳代時(shí)如何洗瓶

對(duì)于用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，你在洗的時(shí)候如果是用無血清 1640 去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會(huì)比用 DMEM 洗的長的要好。同樣，用 1640 培養(yǎng)的也有這個(gè)現(xiàn)象。

如果不嫌麻煩的話，可以用 PBS 來洗，洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對(duì)于有些細(xì)胞會(huì)更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對(duì)胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。

傳代時(shí) PBS 洗是很重要的一步

用 PBS 就可以把細(xì)胞消化開來。加入 PBS 放置 10-15 分鐘，有些需要更長的時(shí)間，等到細(xì)胞一個(gè)個(gè)分離開來的時(shí)候，就可以直接吹打下來。但是和胰酶消化一樣，要控制好時(shí)間，不能時(shí)間太過了。要不然損傷細(xì)胞，細(xì)胞不容易成活，狀態(tài)容易不好。

這個(gè)方法對(duì)于某些細(xì)胞是很管用的。有些細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候，或者臨時(shí)沒有胰酶了，可以選用此方法。不過一定要試試，看是否適合你的細(xì)胞。