表面微生物采樣法效果比較——接觸皿法、淋洗法、試子法
發(fā)布時(shí)間：2019-11-25 瀏覽次數(shù)：12086
在微生物控制中，表面微生物總數(shù)可以作為評估生產(chǎn)過程中微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的級別。微生物采樣涉及醫(yī)療、食品衛(wèi)生、制藥工業(yè)、航空航天等各個(gè)領(lǐng)域，而物體表面微生物采樣更是其中極重要的一個(gè)方面表面微生物取樣相對比較困難，微生物附著在物體表面上，如果微生物采樣方法不適合，很難檢測到實(shí)際微生物數(shù)量。在實(shí)際微生物采樣過程中物體表面的材質(zhì)和粗糙度都有所不同，不同的污染媒介和微生物都會影響采樣結(jié)果。
拭子采樣法于 1997 年被作為定量和半定量表面微生物采樣的標(biāo)準(zhǔn)方法，主要借助消毒拭子擦拭待檢測表面，再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)；而新版 GMP 和藥典中均提及接觸皿采樣法可作為表面微生物采樣方法，本研究通過接觸皿采樣法、拭子采樣法、淋洗采樣法進(jìn)行比較，評估了各采樣法的采樣效果，為接觸皿采樣法的應(yīng)用提供借鑒。
材料與方法
1. 所需材料、試劑及儀器
金黃色葡萄球菌 ATCC6538
大腸埃希菌ATCC25922
枯草芽胞桿菌ATCC6633
銅綠假單胞菌 ATCC9027
白色念珠菌ATCC10231
黑曲霉 ATCC16404
型培養(yǎng)箱、型菌落計(jì)數(shù)儀
316L 型不銹鋼板
接觸皿
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基( TSA)接觸皿;
沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基( SDA) 接觸皿;
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基( NA) 接觸皿
PH = 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液
2. 方法
2.1 菌懸液配制
接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌至胰酪 TSA 培養(yǎng)基斜面中，于 30 ℃ ～ 35 ℃ 培養(yǎng) 18 h ～ 24 h; 接種黑曲霉、白色念珠菌至 SDA 培養(yǎng)基斜面中，于 23 ℃ ～ 28 ℃培養(yǎng) 48 h ～72 h，上述培養(yǎng)物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每0． 1 ml含菌數(shù)分別為1 cfu ～ 10 cfu 的低濃度菌懸液和50 cfu ～ 100 cfu 的高濃度菌懸液，并在 24 h 內(nèi)使用。
2.2 菌種載體的制備
取面積為 25 cm2 的 316L不銹鋼板作為載體。載體于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂和滅菌處理。采用濕熱滅菌法( 121 ℃，30 min) 對經(jīng)過脫脂處理后的載體進(jìn)行滅菌處理。將經(jīng)滅菌的載體平鋪于無菌平皿內(nèi)，逐片滴加菌液，菌液滴加量每片為0.1 ml，將菌液均勻擦拭整個(gè)載體表面，滴染菌液后于層流臺下吹干。
2.3 具體操作
將制備后的菌種載體分為 2 組，每組 3 片 ～ 5 片，分為取樣檢測組和實(shí)際活菌檢測組，同時(shí)另取 3 片未染菌的載體做為陰性對照組。
取樣檢測組: 使用待評估的微生物取樣方法對菌種載體微生物進(jìn)行采樣，制備供試液后檢測各菌種載體上活菌數(shù)。
實(shí)際活菌檢測組: 將菌種載體放入裝有 100 ml 生理鹽水的燒杯中，使用漩渦振蕩器振蕩 3 min 后，取出燒杯中的生理鹽水作為供試液，采用薄膜過濾法在TSA( 細(xì)菌) 或 SDA( 霉菌) 90mm 平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，檢測菌種載體上菌落數(shù); 分別對 3 個(gè)菌種載體進(jìn)行檢測，以3 次檢測結(jié)果的平均值作為菌種載體的實(shí)際活菌數(shù)。
陰性對照組: 將未染菌的載體放入裝有 100 ml 生理鹽水的燒杯中，使用漩渦振蕩器振蕩 3 min 后，取出燒杯中的生理鹽水作為供試液，采用薄膜過濾法分別在 TSA及SDA90mm 平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以 3 片未染菌的載體計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為陰性對照結(jié)果。
接觸皿采樣法：
TSA、NA 和SDA 培養(yǎng)基接觸皿( φ55 mm，面積為25 cm2 ) ，取下皿蓋將培養(yǎng)基凸起面按壓到采樣物體表面5 s ～ 10 s 后，將皿拿起蓋好皿蓋，細(xì)菌置于30 ℃ ～ 35 ℃培養(yǎng)48 h，真菌于23 ℃ ～28 ℃培養(yǎng)72 h 觀察計(jì)數(shù)。TSA 接觸皿測試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉、白色念珠菌; NA 接觸皿測試菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌; SDA 接觸皿測試菌種為黑曲霉、白色念珠菌。
淋洗采樣法：
將20 ml 生理鹽水緩緩傾注到裝有菌種載體的平皿中，傾注時(shí)注意液體傾注點(diǎn)處于菌種載體中心位置，全部傾注后，將無菌平皿輕輕向上下左右各晃動5 次，晃動幅度大概在2 cm ～3 cm，之后使用移液槍將平皿中的生理鹽水全部取出，作為供試液，取10 ml 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，采用薄膜過濾法，濾干后取出濾膜，細(xì)菌濾面朝上貼于TSA 90mm平板培養(yǎng)基和NA 90mm平板培養(yǎng)基上，真菌濾面朝上貼于SDA90mm平板培養(yǎng)基上，細(xì)菌置于30 ℃ ～ 35 ℃培養(yǎng)48 h，真菌于23 ℃ ～ 28 ℃培養(yǎng)72 h 觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果的2倍為淋洗取樣活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。
拭子采樣法：
取無菌拭子，用無菌的0． 9%氯化鈉溶液5 ml 浸濕，在取樣點(diǎn)處選擇約為25 cm2取樣面上擦拭，完成后迅速將拭子放入無菌試管中并密封，加入10 ml 0． 9% 生理鹽水，使用旋渦振蕩器充分振蕩后作為供試液，取5 ml 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)采用薄膜過濾法過濾，濾干后取出濾膜，細(xì)菌濾面朝上貼于TSA90mm平板培養(yǎng)基和NA 90mm平板培養(yǎng)基上，真菌濾面朝上貼于SDA90mm 平板培養(yǎng)基上，細(xì)菌置于30 ℃ ～ 35 ℃ 培養(yǎng)48 h，真菌于23 ℃ ～ 28 ℃培養(yǎng)72 h 觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果的2 倍為擦拭取樣活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。
通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，回收率以3 次實(shí)驗(yàn)測試值的平均值計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)要求: 回收率≥70%。
結(jié)果
低含菌量和高含菌量的載體上TSA 接觸皿、NA接觸皿、SDA 接觸皿采樣，與淋洗采樣和拭子采樣比較，回收率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0． 05) 。接觸皿采樣、淋洗采樣、拭子采樣在低含菌量( 1 cfu /25 cm2 ～ 10 cfu /25 cm2 ) 的物體表面的采樣回收率高于在高含菌量( 50 cfu /25 cm2 ～100 cfu /25 cm2 ) 的物體表面的采樣回收率，但均能達(dá)到70%以上。
結(jié)論
在食品藥品企業(yè)生產(chǎn)車間，生產(chǎn)工具、儀器設(shè)備表面的微生物含量直接影響產(chǎn)品的最終質(zhì)量，拭子采樣法是一種較早用于表面微生物檢測的方法，但是由于拭子檢測法需要將拭子上的微生物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，不僅增加了檢測步驟，而且容易在轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生假陽性。接觸皿采樣法作為一種表面微生物檢測方法，不僅便于使用節(jié)省人力且對使用條件要求較低，例如不需要高壓滅菌鍋、超凈臺等，因此接觸皿用于表面微生物的檢測更加方便快捷。
